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旋渦混合器提取質(zhì)粒DNA

更新時間:2013-09-09   點擊次數(shù):5038次

從大腸桿茵中提取質(zhì)粒DNA的方法很多,其中的堿性別方法提取質(zhì)粒是基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性存在差異而予以分離的。在強堿性條件下,染色體洲A和質(zhì)粒DNA均變性(雙鏈解開)。由于質(zhì)粒DNA是共價閉合環(huán)狀超螺旋結(jié)構(gòu),變性后兩條互補鏈不會*分開。當溶液pH調(diào)節(jié)到中性時.質(zhì)粒DNA容易復(fù)性并溶解在溶液中,而染色體DNA不容易復(fù)性,互相繼繞.在利用臺式高速離心機進行離心時極易和蛋白質(zhì)—3Ds復(fù)合物等一起沉淀下來。轉(zhuǎn)移出上演液,再用乙醇沉淀出其中的質(zhì)粒DNA。具體操作步驟如下:

 

    (1)接種一單菌落于100ml LB液體培養(yǎng)基中,加入50μl的氨芐青霉素,37℃振蕩培養(yǎng)8—10h,使培養(yǎng)達到飽和狀態(tài)。

    (2)取1.5ml培養(yǎng)液利用臺式高速離心機離心20s,沉淀用100μl GTE懸浮并于室溫放置5min。

    (3)加入200μl NaOH/SDS溶液,混勻,于冰上放置5min。

    (4)加入150μl KAc溶液,在MixMax旋渦混合器上振蕩2s,于冰上放置5min。

    (5)離心3min,然后吸取0.4ml上清液移入干凈的微量離心管中,加入0.8ml無水乙醇,室溫靜置2min。

    (6)室溫下通過臺式高速離心機進行離心3min,(使用臺式高速離心機時一定要注意轉(zhuǎn)速、時間控制以及操作規(guī)范)用lml 70%的乙醇洗滌沉淀,然后真空于燥。

    (7)沉淀用30μl dd HO溶解,-20℃保存。

 

皖公網(wǎng)安備 34010402701421號

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